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细菌培养与药敏试验方法及其在临床的应用

发布时间:2017-11-21

临床微生物诊断主要是为感染性疾病是否有细菌性感染提供快速且有效的信息。细菌分离培养主要用于临床标本中细菌的分离,通过分离,使细菌在平板上分散生长,便于观察菌落特性,也易于挑取单个菌落进行药敏试验或生化鉴定;测定抗菌药物在体外对病原微生物有无抑菌或杀菌作用的方法被称为抗菌药物敏感性试验,简称药敏试验。各种致病菌对不同抗菌药的敏感性不同,同种细菌的不同菌株对不同抗原药物的敏感性也有差异,而由于抗菌药物的广泛使用所产生的选择性压力,使耐药菌株也随之增加。通常细菌培养需要至少24~72小时,很多临床病例无法等待这么长的时间之后再进行治疗,那么,对于一些较为特定的临床症状,特定的病原菌,以及特定的药物敏感性的了解,建立一个细菌培养与药敏试验数据库往往能为前期用药的准确度提供一定的依据,同时,这种诊断的准确度又需要通过细菌培养、药敏试验来进行确定,在进行细菌培养之前,需要注意采样方法,样本质量,并提前对样本进行显微镜检查。

1       细菌培养

1.1   细菌培养前注意事项

    在细菌培养之前,对潜在感染样本进行直接显微镜检查是一项重要且有效的检查,有时可获得细菌的数量、形态以及革兰氏染色特征,当样本细菌量达到104~105/mL时,样本所含细菌较易被检查出来[1]。但对于脑脊液或血液等,因为即便感染细菌量可能也比较少,显微镜检查不易检出,同时,对于一些细菌如支原体或螺旋体,因为常规染色无法很好的着色,也不易检出。对于这些情况,需要进行细菌培养以确定。

    细菌培养的样本一般为组织、棉拭子、血液、穿刺液、渗出液、尿液、粪便等,不同的样本需要不同的采样方式,或者不同时间的样本。需注意的是,采样前,确保准确的位置,同时注意消毒(图1)。

                       1 细菌培养采样区域

      在送检样本时,除了提供完整的样本信息,病史等,还需保证样本能够及时送检到相应的实验室,用于盛装样本的容器一定是无菌的,且在运输过程中,需保证无其他细菌感染且细菌相对数量不会改变。尽量在使用抗生素之前或者下次使用抗生素之前采集样本,尽量避免药物作用。

1.2   细菌培养过程

细菌培养的基本条件包括培养基,培养箱,接种用具,无菌室及生物安全柜。

1.2.1         培养基的选择:细菌培养的培养基包括化学培养基、基础营养培养基、富含营养培养基、厌氧培养基、选择培养基以及鉴别培养基,不同培养基具有不同的作用,一般临床分离细菌的常规培养基主要是血平板培养基(blood agar)和麦康凯培养基(MacConkey agar ),临床常见培养基及其用途如表1

培养基 用途 糖或其他基质
PH指示剂
抑制剂
营养培养基Nutrient agar
基础培养基
-
-
-
血平板培养基Blood agar
大多数菌可生长,包括苛性菌
红细胞(显示溶血)
-
-
麦康凯培养基MacConkey agar
肠杆菌科及一些其他的G-杆菌
乳糖
中性红
胆盐
EMB 培养基   EMB agar
鉴定大肠杆菌
乳糖 蔗糖
曙红 亚甲蓝
-
1 常见培养基用途

1.2.2         接种

如果样本量为组织,用消毒后的镊子与剪刀制作新鲜无菌创面,使其于培养基上均匀涂布,或者用刀片刮取组织边缘,并涂布于培养基上;如果样本为液体或半流体,可用无菌棉拭子将液体混匀后蘸取液体均匀涂布于培养基上,当样本为尿液且需要对尿液进行细菌计数时,需对样本进行无菌稀释,然后再均匀涂布于培养基。需注意的是,所有样本,应先接种于无选择性培养基(血平板培养基),然后再接种于选择培养基(麦康凯培养基)或指示培养基。需注意培养温度、时间以及细菌生长所需的气体环境。

1.2.3         分区划线:

分区划线的目的是获得单个细菌菌落,用于观察细菌菌落形态,药敏实验以及生化细菌的鉴定。首先需在平板上进行标记(样本类型,接种时间等),采用多区域法进行划线(图2),每次划线前需对接种环进行灼烧,等待冷却后进行划线,划线的间距或次数取决于对样本细菌量的评估,划线时需保持接种环与平板的表面平行(图3),尽量不要刺破培养基。当细菌量被评估较少,或者在培养24小时之后进行纯化时,可以采取二象限划线法或四象限划线法(图4)。

2 多区域划线法                                        3 细菌接种 划线方向

二象限与四象限划线法

1.2.4         培养条件

除了培养基的要求,细菌的生长还需要考虑温度,培养时间,以及培养环境,大部分细菌可以在实验室常规培养条件下进行生长,一些苛性菌如一些分枝杆菌在改变某些条件的情况下也可生长,如表2,但是一些细菌,如立克次体,嗜血支原体,衣原体,在现有的条件下不能或者很难培养。

2 不同细菌所需不同培养条件

2       药敏实验

虽然人医上很早就引进了药敏试验的说法,但在兽医临床细菌药敏试验在1999年由美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)颁布。常用的药敏试验方法主要有3种:纸片扩散法,液体培养基稀释法,琼脂稀释法。在兽医临床及一些小型实验室,纸片扩散法较为常用,液体培养基稀释法可以提供最小抑菌浓度,也是较为常用的方法。下面对纸片扩散法进行概述。

2.1   原理:将含有一定浓度药物的纸片轻轻的贴到已均匀涂布一定浓度细菌的药敏培养基上,药物会随着培养基琼脂向四周均匀扩散,这样便形成了有抗生素浓度梯度的区域,对此浓度抗生素药物敏感的细菌便不会在此区域生长,这个药物浓度便是这种细菌的最小抑菌浓度(MIC),但本方法并无法准确的测量这个浓度。最终通过测量抑菌圈的大小来判读细菌对每种不同药物的敏感或者耐药程度。

2.2   具体方法与结果判读

挑取18-24h的纯培养菌落于无菌生理盐水中混匀,制备成0.51.0麦氏单位浓度的菌悬液,与标准比浊管对比。用无菌棉拭子蘸取菌液,在管壁上挤压几次,压去多余的菌液,涂布整个MHA平板表面,再重复两次,每次旋转平板60°,使整个平板涂布均匀,最后用棉拭子涂布平板四周边缘。涂布菌液的平板于室温中干燥3-5min后,用纸片分配器或无菌镊子取药敏纸片,贴于平板表面,并用镊子夹轻压一下纸片使其平整牢固。35℃下培养16~18个小时,读取抑菌圈直径,个别菌的孵育温度、时间及条件需按照美国临床与实验室标准化协会(CLSI)规定,根据CLSI 的最新标准,将所测量的抑菌圈大小报告为敏感(susceptible S )、中介(intermediate M )或耐药(resistant R)。敏感即使用某种药物的常规剂量,治疗该种细菌引起的感染有效,即使用该药常规剂量时所达到的平均血药浓度达到MIC4~8倍以上;中介是指当细菌引起的感染尽在应用高剂量抗菌药时有效,或细菌处于体内抗菌药浓缩的部位或体液中时才被抑制,中介时达到平均血浓度一般相当于或略高于MIC;耐药是指药物对某一菌的MIC值高于药物在血及体液内可能达到的浓度,或细菌能产生灭活抗菌药的酶或其他耐药机制。

2.3   对于药敏试验的影响因素

2.3.1         影响抑菌圈大小的因素

2.3.1.1     菌液浓度,一般制备成0.5麦氏单位的浓度,这样的浓度一般可达到使细菌菌落平铺在培养基上,便于结果判读。需注意的是菌液浓度越大,抑菌环出现越早、越小,反之越慢、越大。

2.3.1.2     培养基:一般使用WHO推荐的MHAMuellerHinton agar)培养基,其厚度与PH都有一定的标准,比较有利于肉眼判读,能够满足大部分致病菌的应用需求,同时含少量的四环素、磺胺抑制剂,其含有的低胸腺嘧啶是与磺胺类药物竞争的物质,但也需要经常进行质量控制实验。

2.3.1.3     对生长条件要求较高的细菌,需加入营养增补剂,如测定链球菌属、肠球菌属细菌和脑膜炎奈瑟菌时需在MHA中加入5%脱纤维羊血。然而加入血液后,抑菌圈会比常规小2~3mm

2.3.1.4     培养条件与时间,大部分细菌在35度培养16~18小时即可,但链球菌需要24小时。

2.3.2         对于某些细菌抑菌圈判读特殊要求

2.3.2.1     若抑菌圈内有独立生长的菌落,则提示可能有杂菌,需重新分离鉴定;

2.3.2.2     变形杆菌可能蔓延到抗生素抑菌圈内,明显抑菌圈内的薄膜样爬行可忽略不计;

2.3.2.3     某些细菌磺胺类药物的抑菌圈内可能有微量细菌生长,可忽略不计;

2.3.2.4     血平板培养的链球菌,对青霉素、苯唑西林、甲氧西林的抑菌圈会较正常小2~3mm

参考书目:

[1]Bryan Markey, Finola Leonard: Clinical Veterinary Microbiology 2th .2013

[2]Craig E. Greene: Infectious diseases of the dog and cat 4th ed . 2012

[3]周庭银.临床微生物学诊断与图解.2012

[4]Andrews JM. For the BSAC working party on susceptibility testingBSAC standardized disc susceptibility testing method[J]. Antimicrob Chemother200148Suppl 1):43-57.